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Aus der Abteilung für Klinische PharmakologieLeiter: Prof. Dr. med. S. EndresMedizinische Klinik und Poliklinik IVKlinikum der Universität MünchenLudwig-Maximilians-Universität MünchenDirektor: Prof. Dr. med. M. ReinckeRegulation der Immunantwort:CCL22 und CCL17 vermitteln die Interaktion zwischendendritischen Zellen und regulatorischen T-ZellenDissertationzum Erwerb des Doktorgrades der Medizinan der Medizinischen Fakultät derLudwig-Maximilians-Universität zu Münchenvorgelegt vonMaximilian W. M. Wintergerstaus Trostberg2017
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IIIMit Genehmigung der Medizinischen Fakultätder Universität MünchenBerichterstatter:Priv. Doz. Dr. med. David AnzMitberichterstatter:Prof. Dr. med. Thomas KirchnerProf. Dr. rer. nat. Dolores SchendelPriv. Doz. Dr. rer. nat. Reinhard ObstMitbetreuung durch diepromovierten Mitarbeiter:Prof. Dr. med. Stefan EndresDekan:Prof. Dr. med. dent. Reinhard HickelTag der mündlichen Prüfung:01.06.2017
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VLudmilaund meinen ElternEva und Wilhelm
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VIIEidesstattliche VersicherungHiermit erkläre ich, Maximilian Wintergerst, an Eides statt,dass die vorliegende Dissertation mit dem ThemaRegulation der Immunantwort: CCL22 und CCL17 vermitteln die Interaktionzwischen dendritischen Zellen und regulatorischen T-Zellenselbstständig verfasst, mich außer den angegebenen keiner weiteren Hilfsmittelbedient und alle Erkenntnisse, die aus dem Schrifttum ganz oder annäherndübernommen sind, als solche kenntlich und nach ihrer Herkunft unter Bezeichnung derFundstelle einzeln nachgewiesen habe.Ich erkläre des Weiteren, dass die hier vorgelegte Dissertation nicht in gleicher oder inähnlicher Form bei einer anderen Stelle zur Erlangung eines akademischen Gradeseingereicht wurde.München, 01.06.2017Maximilian Wintergerst
VIIIInhaltsverzeichnis1Einleitung . 11.1Das angeborene und das adaptive Immunsystem . 11.2Dendritische Zellen . 21.2.1Entstehung und Einteilung . 21.2.2Aktivierung von dendritischen Zellen . 31.2.3Die Torwächter des Immunsystems . 51.2.4Vakzinierung mit dendritischen Zellen . 61.3Regulatorische T-Zellen . 61.3.1Entstehung und Einteilung . 71.3.2Mechanismen der Suppression . 81.4Chemokine . 101.4.1Die Funktion von Chemokinen . 111.4.2Die Chemokine CCL22 und CCL17 . 112Zielsetzung . 133Material . 1443.1Geräte . 143.2Chemikalien und Lösungen . 153.3Reagentiensätze / Kits . 153.4Materialien für die Zellkultur . 163.5Zytokine, Wachstumsfaktoren, Peptide und Stimulantien. 173.6short-interfering RNAs (siRNAs) . 183.7Antikörper . 183.8Enzyme . 183.9Primer . 193.10DC2.4 Zelllinie . 193.11Versuchstiere. 193.12Software . 20Methoden. 214.1Zellkultur . 214.1.1Allgemeine Kulturbedingungen . 214.1.2Zellzahlbestimmung . 214.1.3Zellisolation und -aufreinigung . 214.1.3.1 Isolation muriner Splenozyten . 214.1.3.2 Isolation murinen Knochenmarks . 22
IX4.1.3.3 Isolation humaner peripherer Blutlymphozyten und Monozyten. 224.1.3.4 Zellaufreinigung mittels magnetischer Zellsortierung . 234.1.4Zellgenerierung. 234.1.4.1 In vitro Generierung muriner bone-marrow-derived-dendritic-cells(BMDCs) . 234.1.4.2 In vitro Generierung humaner blood-monocyte-derived-dendritic-cells(hBMDCs) . 244.1.54.2Molekularbiologische Methoden. 244.2.1Extraktion zytoplasmatischer RNA . 244.2.2Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren . 254.2.3Reverse Transkription. 254.2.4Polymerase-Kettenreaktion. 264.2.5Gelelektrophorese . 274.2.6DNA Extraktion aus einem Agarosegel . 284.2.7Sequenzeinbau in ein Plasmid . 284.2.8Klonierung eines Plasmides. 294.2.9Plasmidpräparation . 294.2.10Virusgenerierung und Transfektion . 294.2.11Knockdown mittels RNA-Interferenz . 314.3Enzyme-linked immunosorbent assay. 314.4Durchflusszytometrie . 324.4.1allgemeines Funktionsprinzip . 324.4.2Bestimmung von Oberfächenmolekülen . 324.4.3Bestimmung von intrazellulären Molekülen . 334.5Vakzinierung von Mäusen mit dendritischen Zellen . 334.5.1Stimulation und Beladung von dendritischen Zellen mit OVA257-264 . 334.5.2Vakzinierung der Mäuse . 334.6Interferon-γ Restimulationsassay . 334.7In vitro Kontaktanalyse . 344.7.1Etablierung des dreidimensionalen Kontakt- und Migrationsassays . 344.7.2Versuchsaufbau. 374.7.3Auswertung . 394.85Zellfärbungen. 24Statistische Analyse. 41Ergebnisse. 425.1CCL22 Produktion dendritischer Zellen führt selektiv zu mehr Kontakten mitregulatorischen T-Zellen . 42
X5.1.1DC-Treg-Zell-Kontakte sind unter CCL22 Überexpression durch DCsvermehrt .425.1.2DC-Treg-Zell-Kontakte sind unter selektivem CCL22 Knockout in DCsverringert . 445.1.35.2DC-Treg-Zell-Kontakte sind unter CCL22 Knockdown in DCs verringert . 46CCL17 Produktion dendritischer Zellen führt selektiv zu mehr Kontakten mitregulatorischen T-Zellen . 475.2.1DC-Treg-Zell-Kontakte sind unter CCL17 Überexpression durch DCsvermehrt .485.2.2DC-Treg-Zell-Kontakte sind unter CCL17 Knockdown in DCs verringert . 495.3CCL22-vermittelte Kontaktformation ist CCR4-abhängig . 515.4In vivo induzieren CCL22-defiziente dendritische Zellen eine verstärkteImmunantwort . 525.5CCL22 und CCL17 Produktion dendritischer Zellen führt auch im humanenSystem selektiv zu mehr Kontakten mit regulatorischen T-Zellen . 5365.5.1DC-Treg-Zell-Kontakte sind unter CCL22 Knockdown in DCs verringert . 545.5.2DC-Treg-Zell-Kontakte sind unter CCL17 Knockdown in DCs verringert . 55Diskussion . 576.1Kontaktformation regulatorischer T-Zellen mit dendritischen Zellen wird überCCL22 und CCL17 vermittelt . 576.2Kontaktformation regulatorischer T-Zellen mit dendritischen Zellen überCCL22 und CCL17 ist selektiv für regulatorische T-Zellen. 606.3Funktionelle Bedeutung der Kontaktformation regulatorischer T-Zellen mitdendritischen Zellen . 626.4Diskussion widersprüchlicher Literatur zu CCL17 . 646.5Übertragbarkeit auf den Menschen und klinisch-therapeutische Ansatzpunkte .667Zusammenfassung . 698Literaturverzeichnis . 719Abkürzungsverzeichnis . 8710Danksagung . 8911Veröffentlichungen . 9012Lebenslauf . 93
11 Einleitung1.1 Das angeborene und das adaptive ImmunsystemUnser Körper ist einer konstanten Bedrohung durch Pathogene, wie Bakterien und Viren,aber auch durch neoplastische Zellen ausgesetzt. Um diesen Bedrohungen entgegenzu wirken hat sich im Laufe der Evolution das Immunsystem entwickelt (Pancer andCooper 2006, Litman et al. 2010). Dieses besteht aus zwei Teilen: dem angeborenenund dem adaptiven Immunsystem (Marrack and Kappler 1994). Ersteres beinhaltet ndPhagozytenwieMakrophagen, dendritischen Zellen und Neutrophile. Das angeborene Immunsystemerkennt Pathogene anhand typischer struktureller und funktioneller Eigenschaften unddies mit stets den gleichen Erkennungs-Mechanismen. Allerdings machen zu lsweiseViren,eineAnpassungsfähigkeit des Immunsystems notwendig. Aus diesem Grund entwickelte sichdas adaptive Immunsystem. Dieses lässt sich in die Population der T- und der B-Zellenunterteilen. Während zytotoxische T-Zellen der Zell-vermittelten Abwehr dienen, machenB-Zellen den humoralen Teil einer Immunantwort aus. T-Helfer (Th)-Zellen kontrollierenzusammen mit Antigen-präsentierenden-Zellen die Entstehung einer Immunantwort undbestimmen, ob sich eine Typ 1 (zelluläre) oder eine Typ 2 (humorale) Immunreaktionentwickelt.Diese Einteilung ist nicht immer eindeutig, wie am Beispiel der Natürlichen Killer Zellenzu sehen, welche sowohl Merkmale des angeborenen, wie auch des adaptivenImmunsystems aufweisen (Biron 2010, Vivier et al. 2011). Auch findet eine gegenseitigeBeeinflussung beider Arme des Immunsystems statt. Am eindrücklichsten ist dies an derAntigenpräsentation durch die Antigen-präsentierenden-Zellen des angeborenenImmunsystems zu sehen, welche den Anfang jeder Immunantwort des adaptivenImmunsystems ausmacht (Janeway 1989, Hoebe et al. 2004, Iwasaki and Medzhitov2015).Auf Grund ihrer Schlüsselfunktion bei der Generierung und Steuerung derImmunreaktion stellen die dendritischen Zellen eine der bedeutendsten Schnittstellenzwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem dar.
21.2 Dendritische ZellenDie dendritische Zelle (DC) wurde 1973 von Steinman und Cohn entdeckt (Steinmanand Cohn 1973) und als Zellen mit multiplen Zellausläufern beschrieben. Wenige Jahrespäter wurde herausgefunden, dass sie Antigene binden können (Van Rooijen 1978)und eine entscheidende Rolle bei der Entstehung einer Immunantwort spielen (Steinmanand Witmer 1978, Boog et al. 1985, Inaba and Steinman 1985). Im Jahre 2011 wurdeRalph M. Steinman posthum für die Entdeckung der dendritischen Zelle der Nobelpreisfür Physiologie oder Medizin verliehen (Nobelassembly 2011).1.2.1Entstehung und EinteilungDCs entstehen aus Vorläuferzellen aus dem Knochenmark und benötigen für ihreDifferenzierung in vivo Flt3L (Maraskovsky et al. 1997, Naik et al. 2007, Onai et al. 2007).Ebenfalls eine wichtige Rolle spielen Monozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF)(Pixley and Stanley 2004), Granulozyten-Monozyten-Kolonie-stimulierender Faktor(GM-CSF) (Sallusto and Lanzavecchia 1994), Lymphotoxin β (Wu et al. 1999) undTransforming growth factor (TGF)-β (Borkowski et al. 1996). Mittlerweile hat man vieleverschiedene Subklassen von DCs gefunden, deren Einteilung noch Gegenstandaktueller Diskussion ist (Heath and Carbone 2009, Reizis et al. 2011, Satpathy et al.2012, Steinman 2012, Heath and Carbone 2013).Vereinfachend lassen sich DCs im Immunsystem der Maus in verschiedeneSubkategorien einteilen, diese sind zusammen mit ihrer jeweiligen Funktion in Tabelle 1dargestellt.Tabelle 1: verschiedene Subklassen von dendritischen Zellen in der MausBezeichnungPlasmazytoide DC (pDC)FunktionFörderung der angeborenen Immunitätdurch Interferon (IFN) -α SekretionCD8 DC/ CD103 DC(im Lymphorgan) / (in der Peripherie)CD4 DC/ CD11b DC(im Lymphorgan) / (in der Peripherie)Langerhans-ZelleModifiziert nach (Heath and Carbone 2013)Förderung der zellulären Immunantwort(CD8 T-Zellen); KreuzpräsentationFörderung der humoralen Immunantwort(CD4 T-Zellen)Regulatorische Funktionen
3Beim Menschen lässt sich eine Charakterisierung der verschiedenen DC Subklassenunter anderem anhand der blood-dendritic-cell-antigens (BDCAs) vornehmen (Dzioneket al. 2000). Den CD (Cluster of differentiation) 8 DCs in der Maus entsprechenBDCA3 DCs und den CD11b DCs der Maus entsprechen BDCA1 DCs (Satpathy etal. 2012).Die pDCs haben eine sphärische Gestalt und ähneln den Antikörper-sezernierendenPlasmazellen. Sie sind nicht-phagozytisch und entsprechend uneffektiv bei der AntigenPräsentation (Reizis et al. 2011). Sie dienen der schnellen Erkennung einer viralenInfektion unter anderem über Toll-like-Rezeptor 7, worauf hin sie große Mengen von IFNα produzieren (Hornung et al. 2005). Alle übrigen DC-Subklassen lassen sich als"klassische“ (früher: myeloide) DCs zusammenfassen. Sie haben eine dendritischeMorphologie, eine kürzere Lebensdauer von drei Tagen bis zwei Wochen, phagozytierenund prozessieren, um Antigene in peripherem Gewebe aufzugreifen und migrieren zuden sekundären Lymphorganen. Dort präsentieren sie die Antigene in den T-Zell-Zonenund können eine Immunantwort hervorrufen (Randolph et al. 2005, Ginhoux et al. 2009).1.2.2Aktivierung von dendritischen ZellenNeu geschaffene, unreife klassische DCs haben noch eine hohe endozytotische Aktivitätund geringe Major-Histocompatibility-Complex (MHC)-I und -II Expression. Dies ändertsich nach Kontakt mit Pathogen-associated-molecular-patterns (PAMPs), ammatorischenZytokinen:diePhagozytose und Protein-Prozessierung wird für wenige Stunden gesteigert und darauffolgend herunter reguliert sowie die MHC-Dichte auf der Zelloberfläche verstärkt, um dieaufgefangenen Antigene zu präsentieren (Pierre et al. 1997, Mellman and Steinman2001, Trombetta et al. 2003). Dieser Prozess wird Aktivierung, beziehungsweise Reifung(engl. maturation) genannt. Die Expression von MHC-Molekülen auf DCs wurde 1979und der Prozess der Aktivierung 1985 das erste Mal beschrieben (Rouse et al. 1979,Schuler and Steinman 1985).DCs können durch verschiedene Stoffe und Signale aktiviert, also zu reifen DCs werden.Bei der Erkennung dieser spielen Pattern-recognition-receptors (PRRs) eineentscheidende Rolle.
4Eine der bekanntesten PRRs sind die Toll-like-Rezeptoren (TLR). Jeder der 12 TLRs inMäusen, beziehungsweise 10 in Menschen erkennt eine einzigartige Gruppe vonLiganden. So erkennt der an der Zelloberfläche exprimierte TLR 4 beispielsweiseLipopolysaccharide (LPS) von bakteriellen Zellwänden und der im Endolysosombefindliche TLR 9 bakterielle Cytosin- und Guanin-reiche Oligonukleotid (CpG ODN)DNA (Lee et al. 2012). Für CpG ODN konnte gezeigt werden, dass sie eine starkeAktivierung von murinen (Sparwasser et al. 1998) und humane DCs (Hartmann et al.1999) hervorrufen. Eine weitere Gruppe von PRRs der DCs bilden die C-Typ nPilzenabstammendeZuckerverbindungen Calcium-abhängig erkennen (Sancho and Reis e Sousa 2012). omerizationdomainähnlichenRezeptoren (NOD-like-Rezeptoren) binden unter Anderem bakterielle Peptidoglykaneund spielen ebenfalls eine Rolle bei der Aktivierung von DCs (Franchi et al. 2012). Diegleichermaßen intrazellulär liegenden Retinoic-acid-inducible-gene I (RIG-I)-ähnlichenRezeptoren erkennen virale Ribonukleinsäuren und führen, wie auch die NOD-likeRezeptoren zu einer Aktivierung des NF- B Signalweges oder des Inflammasoms(Hammer and Ma 2013). Die hier besprochenen PRRs sind Rezeptoren desangeborenen Immunsystems und sind oft spezifisch auf einer Subklasse von DCsexprimiert (Steinman 2012).Neben den PRRs können auch endogene Botenstoffe wie Interleukin (IL)-1 und TumorNekrose Faktor (TNF)-α zu einer Aktivierung von DCs führen (Fujii et al. 2004, Pang etal. 2013). Auch Zellen wie T-, natürliche Killer-Zellen, natürliche Killer-T-Zellen und ɣ- -TZellen (Fujii et al. 2003, Munz et al. 2005) und Produkte sterbender Zellen (Gallucci etal. 1999) können aktivierend wirken.Wenn es durch einen dieser mannigfaltigen Stimuli zur Aktivierung einer DC kommt,werden Aktivierungsmarker wie MHC-I und –II Moleküle und die CostimulatorischenMoleküle CD80 und CD86 auf ihrer Zelloberfläche hochreguliert (Young et al. 1992,Cresswell 1994, Larsen et al. 1994, Turley et al. 2000). CD80 und CD86 sind für dieImmunogenität der DC von maßgeblicher Bedeutung. Des Weiteren werden CD40,CD274 und CD273 vermehrt exprimiert (Steinman 2012). Der nun von einer DC erreichteZustand wird als phänotypische Aktivierung bezeichnet. Sie ist noch nicht notwendigerWeise auch funktionell aktiviert, also immunstimulatorisch, ja sie kann sogar Toleranzgegenüber einem Antigen erzeugen (Menges et al. 2002, Sporri and Reis e Sousa 2005).Von funktioneller Aktivierung spricht man, wenn sich die DC den minimalen oderkompletten zellulären Veränderungen unterzogen hat, die sie befähigen eine
5Immunstimulation auszulösen (Reis e Sousa 2006). Es ist noch nicht genau verstanden,wie der Prozess der funktionellen Aktivierung abläuft (Steinman 2012).1.2.3Die Torwächter des ImmunsystemsAn der DC entscheidet sich maßgeblich, ob eine Immunantwort gegen ein bestimmtesAntigen entsteht und wenn ja, welche. Hierbei spielt der Aktivitätszustand der DC eineganz entscheidende Rolle. Unreife, also noch nicht aktivierte DCs können in peripherenCD4 und CD8 T-Zellen eine Toleranzreaktion durch Einleitung von Deletion, Anergieoder Regulationsmechanismen auslösen (Steinman and Nussenzweig 2002, Steinmanet al. 2003). Reife DCs sind dagegen in der Lage eine Immunreaktion auszulösen(Banchereau et al. 2000).Um eine T-Zelle auf einen bestimmten Antigen-Reiz hin zu aktivieren sind vereinfachtdargestellt drei äußere Signale notwendig (Schwartz and Mueller 2003). Das erste Signalist die Erkennung eines zum T-Zell-Rezeptor passenden Antigens auf einem MHC-I oder–II Molekül. Erfährt eine T-Zelle dieses Signal, so führt dies zur Toleranzinduktiongegenüber dem Antigen. Das zweite Signal ist die Stimulation einer T-Zelle durch dieCostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86. Hierzu binden CD80 und CD86 an CD28der T-Zelle (Keir and Sharpe 2005). Zusammen mit dem ersten Signal führt dies zurEinleitung einer Immunantwort, die T-Zelle durchläuft eine klonale Expansion und esbilden sich Gedächtnis-T-Zellen aus (Kearney et al. 1994). Das dritte Signal machenZytokine der Antigen-präsentierenden-Zelle aus, die die Richtung der Immunantwort unddamit die weitere genaue Differenzierung der T-Zelle bestimmen (Curtsinger et al. 1999).Die Entstehung eine Typ-1 Th-Zelle und damit einer Typ 1 Immunantwort wird durchIL12, IL18 oder IFN-α eingeleitet (Kapsenberg 2003). Welche Signale zur Entstehungeiner Typ-2 Th-Zelle und damit Typ 2 Immunantwort führen ist noch Gegenstand aktuellerDiskussion (Pulendran et al. 2010, Bell et al. 2013, Bordon 2013). In Zusammenschauder Funktion der DC wird klar, welch wichtige Bedeutung die CostimulatorischenMoleküle CD80 und CD86 haben, da es ohne sie nicht zur Auslösung einerImmunantwort kommen kann.
61.2.4Vakzinierung mit dendritischen ZellenAuf Grund der zentralen Rolle der DC bei der Entstehung einer Immunantwort ist sie einvielversprechender Ansatzpunkt für neue Therapiestrategien durch Immunisierung,beispielsweise im Bereich der Tumortherapie.So fand 1996 die erste Tumor-Vakzinierung mit DCs am Menschen mit gutem Erfolgstatt (Hsu et al. 1996), nachdem erste Versuche hierzu in der Maus 1995 durchgeführtwurden (Mayordomo et al. 1995). Vier Patienten mit follikulärem B-Zell Lymphom wurdenmit Tumor-Antigen beladenen DCs geimpft, hiervon erfuhren zwei eine komplette ndieerstenTumorvakzinierungen mit DCs, welche in vitro mittels IL-4 und GM-CSF generiertwurden, unternommen (Nestle et al. 1998).Während im Menschen durch die Injektion aktivierter DCs eine Immunreaktion gegenein bestimmtes Antigen ausgelöst werden kann (Dhodapkar et al. 1999), lässt sich durchdie Verabreichung unreifer DCs Toleranz gegenüber bestimmten Antigenen hervorrufen(Dhodapkar et al. 2001).Entsprechend kann uns das Wissen über DCs nicht nur helfen, neue Ansätze in derTumortherapie zu finden, sondern auch, vor allem in Kombination mit dem Wissen überihr Zusammenspiel mit regulatorischen T-Zellen, zur Entwicklung neuer Therapiengegen Autoimmunkrankheiten, Allergien und Transplantatabstoßung helfen (Steinmanand Pope 2002, Steinman and Banchereau 2007, Belkaid and Oldenhove 2008,Pulendran et al. 2010).1.3 Regulatorische T-ZellenTada bezeichnete 1997 das Immunsystem als ein Supersystem, also ein höchstkomplexes System mit der Notwendigkeit, sich selbst zu regulieren (Tada 1997). ErsteÜberlegungen über Immunregulation und die Rolle von T-Lymphozyten darin fandenschon in den 70er und 80er Jahren des letzten Jahrhunderts statt (Gershon and Kondo1970, Golub 1981). 1982 entdeckte Sakaguchi, dass sich Autoimmunität in neonatalthymektomierten Mäusen durch Zufuhr von CD4 T-Lymphozyten verhindern ließ, wasdarauf schließen ließ, dass zur Immunsuppression fähige Zellen in der CD4 Zellpopulation enthalten sein müssen (Sakaguchi et al. 1982). Weitere Untersuchungenvon Sakaguchi führten dann 1995 zur Entdeckung dieser spezifischen T-Lymphozyten
7Subpopulation. Sie exprimieren den IL-2 Rezeptor CD25 und sind dazu fähig, dieimmunologische Selbsttoleranz zu erhalten. Sie wurden regulatorische T-Zellen (TregZellen) bezeichnet und machen etwa 5 bis 10% der peripheren CD4 T-Zellen aus(Sakaguchi et al. 1995).Das 1982 von Sakaguchi durchgeführte Experiment erschließt sich bei Betrachtung derFunktion des Thymus für die Entwicklung von T-Lymphozyten. In ihm werden T-Zellenmit T-Zell-Rezeptoren, die eine hohe Affinität zu Selbstantigenen aufweisen depletiert(Kappler et al. 1987, Kisielow et al. 1988). Fällt diese Negativselektion aus, kommt esdurch ständige Selbstantigen Erkennung zur Autoimmunität.2003 wurde der bislang wichtigste Funktionsmarker von Treg-Zellen entdeckt: derTranskriptionsfaktor Forkhead-box-protein P3 (FoxP3). Über erzwungene Expressionvon FoxP3 in konventionellen T-Zellen mittels retroviralen Vektoren konnte einsuppressiver, Treg-ähnlicher Phänotyp erzeugt werden. Außerdem wurde gezeigt, dassFoxP3 zur Entwicklung von Treg-Zellen aus Knochenmarkvorläuferzellen essentiell ist(Fontenot et al. 2003, Hori et al. 2003).Wie wichtig die Treg-Zellen für das normal funktionierende Immunsystem sind, sieht manan Mäusen, die eine Mutation im FoxP3 Gen aufweisen, den „Scurfy Mäusen“ (Brunkowet al. 2001). Diese Mutation entstand spontan in den 40er Jahren des prägtestersystemischerAutoimmunität, unter anderem mit schorfiger (engl. scurfy) Haut und führte innerhalbweniger Wochen post partum zum Tode (Ramsdell and Ziegler 2014). Eine Mutation desFoxP3 Gens beim Menschen führt zu einem ähnlichen Krankheitsbild mit hromosomal vererbtem (IPEX) Syndrom (Bennett et al. 2001).1.3.1Entstehung und EinteilungDie Population der Treg-Zellen lässt sich in zwei Gruppen unterteilen: zum einen in die,den Hauptteil ausmachenden „natürlichen“ Treg (nTreg) - Zellen, die im Thymus alsSelbstantigen-aktivierte, reife T-Zellen entstehen. Die zweite Gruppe der Treg-Zellen wirdvon den, in der Peripherie unter bestimmten Bedingungen „induzierten“ T reg (iTreg) –Zellen mit Selbstantigen oder harmlose Umweltantigene erkennenden T-ZellRezeptoren gebildet (Josefowicz and Rudensky 2009).
8Bei der Entstehung der nTreg-Zellen im Thymus spielt die T-Zell-Rezeptor Bindung anSelbstantigene eine entscheidende Rolle. CD4 CD8- Thymozyten, mit mittelstarkerAffinität zu Selbstantigenen haben die größte Wahrscheinlichkeit sich zu T reg-Zellen zuentwickeln (Josefowicz et al. 2012). In den letzten Jahren haben sich die Hinweise daraufgemehrt, dass zusätzlich zur und unabhängig von der FoxP3 Expression auchspezifische epigenetische Veränderungen essentiell für die Treg-Zell-Entwicklung sind(Ohkura et al. 2013).Die zweite Gruppe der Treg-Zellen, die iTreg-Zellen lassen sich in der Peripherie unterTGF-β und IL-2 Einfluss induzieren (Chen et al. 2003). Längerfristige niedrig-dosigeAntigenstimulation sowie nur mäßige Costimulation sind entscheidende Faktoren die zuriTreg-Zell Entstehung führen (Josefowicz and Rudensky 2009). Sie exprimieren, wie auchdie nTreg-Zellen, FoxP3. Daneben gibt es aber noch zwei weitere induzierbareregulatorische T-Zell-Populationen, die nicht FoxP3 exprimieren: TGF-β produzierendeTh-3-Zellen (Faria and Weiner 2005) und IL-10 produzierende T regulatorische 1 (Tr1)Zellen (Roncarolo et al. 2006).Zusätzlich zur Unterscheidung auf Grund ihrer Entstehung lassen sich Treg-Zellen anHand ihres aktuellen Funktionszustandes in drei Gruppen einteilen: zentrale, Effektorund im peripheren Gewebe befindliche Treg-Zellen. Zentrale Treg-Zellen halten sich in derBlutstrombahn und sekundären lymphatischen Organen auf und werden auch als„ruhende“ oder „naive“ Treg-Zellen bezeichnet. Sie haben vergleichsweise geringesuppressive Aktivität und ihr Antigen-Kontakt liegt tendenziell länger zurück. ImUnterschied hierzu hatten die Effektor Treg-Zellen vor kurzem Antigen-Kontakt und sindentsprechend suppressiver. Auch sie befinden sich in der Blutstrombahn und densekundären lymphatischen Organen, zeigen aber zusätzlich auch Migration in nichtlymphatischen Geweben. Die Gruppe der in peripheren Geweben befindlichen TregZellen hält sich dagegen vor allem in nicht lymphatischem Gewebe, wie zum Beispieldem Darm auf (Liston and Gray 2014).1.3.2Mechanismen der SuppressionTreg-Zellen dienen der Suppression von „irrtümlichen“, weil gegen den eigenenOrganis
aufgefangenen Antigene zu präsentieren (Pierre et al. 1997, Mellman and Steinman 2001, Trombetta et al. 2003). Dieser Prozess wird Aktivierung, beziehungsweise Reifung (engl. maturation) genannt. Die Expression von MHC-Molekülen auf DCs wurde 1979 und der Prozess der Aktivierung 1985 das erste Mal beschrieben (Rouse et al. 1979,