Transcription
Opinnäytetyö (AMK)Bio- ja elintarviketekniikkaBiotekniikka2015Aleksi SaarirantaIHMISEN RINOVIRUSTENVP4/2-GEENIALUEENMONISTAMINEN RT-qPCR MENETELMÄLLÄ
OPINNÄYTETYÖ (AMK) TIIVISTELMÄTURUN AMMATTIKORKEAKOULUBio- ja elintarviketekniikka Biotekniikka2015 25 sivuaPetri Susi (FT), Jarno Pusa (Biot. Ins.)Aleksi SaarirantaIHMISEN RINOVIRUSTEN VP4/2GEENIALUEEN MONISTAMINEN RTQPCR MENETELMÄLLÄRinovirukset ovat yleisiä RNA-viruksia, joiden on todettu aiheuttavan ihmiselle mm. lieviä hengitystieinfektioita, keuhkokuumetta, korvatulehduksia ja astmaa. Viruksia tunnetaan yli 100 tyyppiä.Viruksen genomin 5’ UTR-geenialuetta on käytetty yleisesti rinovirusten tunnistamiseen PCRmenetelmällä, mutta se ei sovellu tyypitykseen. Tässä opinnäytetyössä selvitettiin, onnistuuko650 emäksen pituisen VP4/2-alueen monistaminen RT-qPCR-menetelmällä ja pyrittiin kehittämään optimoitu menetelmä geenituotteen muodostamiseksi. Työssä vertailtiin mm. kaupallisiaqPCR-reaktiosarjoja ja RT-entsyymejä. qPCR-reaktiosarjojen välillä oli selkeitä eroja; KAPASYBR FAST (Kapa Biosystems) ja SensiFAST SYBR No-ROX (Bioline) –qPCR-reaktiosarjat olivat selkeästi herkempiä kuin edullinen MAXIMA SYBR Green (Fermentas) –reaktiosarja. Tuloksetosoittivat, että VP4/2-aluetta pystyttiin monistamaan 100 rinovirusgenomia sisältävästä näytteestä. Menetelmä toimi tehokkaasti viljeltyjen rinovirus-RNA-näytteiden VP4/2-alueen monistamiseen. Menetelmän toimivuus pitää testata jatkossa myös kliinisillä näytteillä menetelmän validoimiseksi kliinis-virologiseen käyttöön.ASIASANAT:RT-qPCR, rinovirukset, diagnostiikka, PCR-optimointi
BACHELOR S THESIS ABSTRACTTURKU UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCESBiotechnology and Food technology Biotechnology2015 25 pagesDr. Petri Susi (PhD); Jarno Pusa (Eng. in Biotechnology))Aleksi SaarirantaTYPING OF HUMAN RHINOVIRUSES BY RT-QPCR USINGVP4/2 GENES AS TARGETRhinoviruses are common RNA viruses which cause mild respiratory infections, pneumonia, otitismedia and asthma. The 5’ UTR viral gene region of rhinoviruses has commonly been used torecognize rhinoviruses by PCR. However, the 5’UTR region is not suitable for the serotyping ofindividual viruses. Therefore, the VP4/2 gene area is commonly used for typing different rhinovirus species. In this Bachelor’s thesis it was studied if it is possible to amplify a 650 base-pair-longVP4/2 gene region by RT-qPCR and also to find optimized conditions. The results showed thatthe VP4/2 gene region could be amplified successfully with reasonable sensitivity. It was possibleto obtain PCR-product from a sample containing only 100 copies of viral genome. The optimization of the RT-qPCR method included the comparison of the commercial qPCR kits and RT enzymes. There were clear differences between the qPCR kits - the KAPA SYBR FAST qPCR Kit(Kapa Biosystems) and the SensiFAST SYBR No-ROX Kit (Bioline) showed significantly highersensitivity than the inexpensive MAXIMA SYBR Green qPCR Kit when amplifying the VP4/2 generegion. All the samples used in this study were cultured rhinovirus samples. Therefore, the functionality of the RT-qPCR method should be tested with clinical virus samples in order to validatethe method.KEYWORDS:RT-qPCR, rhinoviruses, diagnostics, PCR optimization
SISÄLTÖKÄYTETYT LYHENTEET JA SANASTO61 JOHDANTO72 MATERIAALIT JA MENETELMÄT93 TULOKSET123.1 Annealing-lämpötilan optimointi123.2 qPCR-menetelmän herkkyys ja VP4/2-alueen sulamislämpötila133.3 qPCR-reaktiosarjojen vertailu123.4 RT-entsyymien vertailu153.5 RT-entsyymin määrän vaikutus herkkyyteen163.6 ENRI-alueen monistaminen käyttäen VP4/2 HRV/HEV OAS-aluketta173.7 Rinovirustyyppien RNA:sta tehty RT-qPCR194 TULOSTEN TARKASTELU204.1 Annealing-lämpötilan optimointi204.2 qPCR-menetelmän herkkyys ja VP4/2-alueen sulamislämpötila214.3 qPCR-reaktiosarjojen vertailu204.4 RT-entsyymien vertailu214.5 RT-entsyymin määrän vaikutus herkkyyteen224.6 ENRI-alueen monistaminen käyttäen RT-vaiheessa VP4/2 HRV/HEV OASaluketta224.7 Rinovirustyyppien RT-qPCR235 LOPPUPÄÄTELMÄT246 LÄHTEET25
KUVATKuva 1. Rinovirusten genomin rakenne7Kuva 2. Pipetointikaavio11Kuva 3. Annealing-lämpötila optimoinnin agaroosigeeliajot12Kuva 4. qPCR-reaktiosarjojen vertailu13Kuva 5. qPCR käyttäen HRV-plasmideja näytteinä14Kuva 6. Cp-arvot näytteen genomien lukumäärän funktiona14Kuva 7. pHRV-C15-plasmidista monistetun VP4/2-alueen sulamiskäyrä15Kuva 8. RT-entsyymien vertailu käyttäen HRV-A-1b:ta näytteenä16Kuva 9. RT-entsyymien vertailu käyttäen HRV-B14 näytteenä16Kuva 10. RT-entsyymin määrän vaikutus herkkyyteen17Kuva 11. Sulamiskäyräanalyysi18Kuva 12. ENRI-alueen monistaminen käyttäen RT-vaiheessa VP4/2 HRV/HEV OASaluketta18Kuva 13. Rinovirustyyppien qPCR-monistuskäyrät19Kuva 14. Rinovirustyyppien qPCR-sulamiskäyräanalyysi19
LYHENTEET JA jureaktioRTKäänteistranskriptio-reaktio, jossa RNA käännetääncDNA-muotoon.CpKynnyssykli, joka ylittää tietyn kynnysarvon (engl. Crossing point).HRVIhmisen rinoviruspHRVPlasmidi, johon on kloonattu ihmisen rinoviruksen genomiENRIDiagnostinen testi entero- ja rinovirusten tunnistamiseksi
71 JOHDANTORinovirukset kuuluvat Picornaviridae-heimoon, jotka ovat rakenteeltaan vaipattomia, ikosahedraalisia viruksia, ja joiden genomi koostuu RNA:sta. Tällä hetkellärinoviruksia tunnetaan 153 erilaista serotyyppiä, jotka jaetaan kolmeen lajiin: A(n 77), B (n 25) ja C (n 51)(2). Rinovirukset ovat yleisimpiä lievien hengitystieinfektioiden aiheuttajia, mutta tämän lisäksi niiden on havaittu aiheuttavan vakavampia sairauksia, kuten keuhkokuumetta, korvatulehduksia ja astmaa. Rinovirusten kiertokulusta ja yksittäisten serotyyppien vaikutuksesta ihmiseen tiedetäänhyvin vähän.(1,2)Rinovirusten RNA-genomi on pituudeltaan n. 7200 emästä. Kliinisessä virusdiagnostiikassa on viruksen tunnistamiseen käyttäen 5’ UTR-aluetta, joka mahdollistaa myös enterovirusten ja rinovirusten erottamisen toisistaan. Rinovirusten tyypittämiseen on käytetty viruksen genomin VP4/2-aluetta, joka on pituudeltaan n.650 emästä. (1,2,3)Kuva 1. Rinovirusten genomin rakenne (4)Diagnostiikassa virusten tyypittämisellä on suuri merkitys, kun tutkitaan tunnetunvirustyypin yhteyttä tiettyyn sairauteen (3). Kansanterveydellisestä näkökulmastatiettyjä virustyyppejä vastaan voidaan yrittää valmistaa rokote, jos niiden on havaittu aiheuttavan vakavia sairauksia kuten astmaa.TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
8Tässä opinnäytetyössä tutkittiin ihmisen rinovirusten VP4/2-alueen monistamistakvantitatiivisella RT-PCR-menetelmällä (RT-qPCR). Perinteinen PCR-menetelmä on hidas ja epätaloudellinen, varsinkin jos joudutaan tutkimaan monta näytettä samaan aikaan; ensin suoritetaan PCR-ajo, jonka jälkeen jokainen näytejoudutaan analysoimaan erikseen agaroosigeelillä. RT-qPCR-menetelmä perustuu fluoresoivan merkkiaineen käyttöön, joka mahdollistaa syntyvän tuotteen reaaliaikaisen seuraamisen. Ajettaessa monta näytettä kerralla, positiiviset näytteetvoidaan kerätä sekvensoitavaksi, jonka avulla virus voidaan tyypittää. Tämäsäästää aikaa ja resursseja sekä mahdollistaa näytteiden tehokkaan analysoinnin.Työn tavoite oli testata RT-qPCR-menetelmän toimivuus kahdelle eri rinovirusRNA-näytteellä (HRV-A-1b, HRV-B14) ja qPCR:n toimivuus kolmella rinovirusplasmidilla (pHRV-A-1b, pHRV-B14 ja pHRV-C15). Kaupalliset qPCR-reaktiosarjavalmistajat suosittelevat suunnittelemaan alukkeet kitistä riippuen n. 80–400emäsparin pituisille monistettaville cDNA-jaksoille. Työn alussa täytyi testata,pystyttiinkö VP4/2-alueen 650 emäksen pituista palaa ylipäätään monistamaankäytettävillä kaupallisilla kiteillä. Tämän lisäksi menetelmälle määritettiin herkkyys eli miten pientä RNA-määrää pystytään vielä monistamaan luotettavasti.Tuotteen monistuminen määritettiin qPCR-laitteen monistus- ja sulamiskäyriä tarkastelemalla ja ajamalla tuotteet agaroosigeelillä.Yksi työvaiheista oli testata, pystytäänkö 5’ UTR-geenialueella sijaitsevaa ns.”ENRI”-aluetta monistamaan RT-vaiheen jälkeen cDNA:sta, joka oli tehty VP4/2aluetta monistavalla alukkeella. Tavallisesti ”ENRI”-aluetta monistettaessa käytetään sille ominaisia alukkeita(2).Työssä pyrittiin myös optimoimaan parasta menetelmää VP4/2-alueen monistamiseksi testaamalla parasta annealing-lämpötilaa sekä vertailemalla kaupallisiaqPCR-reaktiosarjoja ja RT-entsyymejä.TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
92 MATERIAALIT JA MENETELMÄTVP4/2-geenialueen alukkeet valittiin aikaisempien julkaisuiden perusteella, joissaaluetta oli monistettu onnistuneesti perinteisin menetelmin. Eri vaihtoehdoistapäädyttiin käyttämään VP4/2 HRV/HEV OS- ja VP4/2 HRV/HEV OAS -alukkeita(1,3). Alukeparit olivat alukesekoituksia (eng. wobble primers), joissa tietyissäkohdissa nukleotidi vaihteli (OS CCGGCCCCTGAATGYGGCTAA ja OAS CATRTTYTSNCCAAANAYDCCCAT, I inosiini; Y T, C; R G, A; N A, G,C,T). (3)Työssä käytettiin kolmea eri kaupallista qPCR-reaktiosarjaa: KAPA SYBR FASTqPCR Kit (Bio Systems), SensiFAST SYBR No-ROX Kit (Bioline) ja MAXIMASYBR Green qPCR Kit (Fermentas). qPCR-reaktiosarjojen vertailu suoritettiinkäyttäen HRV-A-1b cDNA-näytettä. Ellei kyseessä ollut eri reaktiosarjojen vertailu, työssä käytettiin pääasiassa KAPA SYBR FAST qPCR-reaktiosarjaa. Valmistajat ovat antaneet suosituksen monistettavan DNA-jakson pituudelle: KAPA;60–400 emästä, SensiFAST; 80–200 emästä ja MAXIMA; 70–150 emästä.Annealing-lämpötilan optimointi suoritettiin Bioradin C1000 Thermal Cycler -laitteella, johon ohjelmoitiin annealing-lämpötilagradientti 52–62 C (52; 52,7; 54;55,9; 58,4; 60,3; 61,4 ja 62 C). Annealing-lämpötilatestaus suoritettiin käyttäenkahta eri rinovirusplasmidia, pHRV-A-1b ja pHRV-B14, KAPA ja SensiFASTinqPCR-reaktiosarjoilla. (reaktiotilavuus 20 µl, jossa 1 µl näyte, 1 µl OAS- & OSalukkeet, 10 µl 2x Master Mix ja 7 µl H2O). PCR-ajon jälkeen näytteet ajettiinagaroosigeelillä ja muodostuneiden bändien intensiteettiä verrattiin toisiinsa.qPCR-ajot suoritettiin Roche Light Cycler 480 II laitteella, jossa reaktiot on pipetoitu 96-kuoppalevylle. Ajo-ohjelma määritettiin annealing-testin ja reaktiosarjojen suositusten perusteella. Ohjelma sisälsi 3 vaihetta: hold- (95 C, 3 min), 45x cycling- (95 C, 10 s; 54 C, 30 s; 72 C, 30 s) ja final extension-vaiheen (72 C, 5 min). Jokaiseen kuoppalevyn kuoppaan pipetoitiin 10 µl 2 x KAPA SYBR FAST Master Mix-seosta, 1µl kumpaakin aluketta ja 8 µl milli-Q-vettä. Ajon jälkeen näytteet analysoitiin geelillä tai varastoitiin -20 C:een.TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
10Työn kaikissa vaiheissa käänteistranskriptio tehtiin käyttäen joko SuperScript IIItai ImProm II- RT-entsyymiä lukuun ottamatta työvaihetta, jossa vertailtiin eri RTentsyymien tehokkuutta. RT-vaihe suoritettiin pipetoimalla kaikki reagenssit 0,5ml eppendorf-putkiin, joihin pipetoitiin 2 µl 5 x puskuria, 1 µl magnesiumkloridia(MgCl2; 2,5 mM), 0,5 µl 10 mM dNTP:tä, 0,5 µl RNaasi-inhibiittoria, 0,5 µl RTentsyymiä, 1 µl OAS-aluketta ja 4,5 µl RNA-näytettä. Näytteet inkuboitiin 42 C:ssa, 60 min 15 min (poikkeuksena SuperScript IV, jota inkuboitiin 10 min, 50 C:ssa ja 10 min 80 C:ssa). RT-vaiheessa käytettiin pääasiassa Promegan 5xbuffer-puskuriliuosta ja RNaasi-inhibiittoria.Työssä käytetyt näytteet olivat joko plasmidinäytteitä tai RNA-näytteitä riippuentyön vaiheista. Annealing-lämpötilan määrityksessä käytettiin plasmideita pHRVA-1b ja pHRV-B14. Herkkyyden määrityksessä käytettiin plasmideita pHRV-A1b, pHRV-B14 ja pHRV-C15. Plasmidikonsentraatio määritettiin Nano Drop 1000-laitteella (Thermo Scientific), jonka jälkeen näytteistä tehtiin 108 kopiota sisältävät näytteet. Tästä näytteestä tehtiin taas laimennossarja 106:sta 10-1:een. Käytetyt RNA-näytteet olivat HRV-A-1b ja HRV-B14. RT-qPCR-menetelmä testattiinlopuksi käyttäen 18 eri HRV-virustyypistä eristettyä RNA:ta.Geeliajot suoritettiin valmistamalla 1 % agaroosigeeli, johon pipetoitiin 2-3 µl Midori Green Advange-reagenssia (Nippon Genetics). Näytteitä ajettiin geelillä 40–60 min, 80 V.Kuvan 2 mukainen pipetointi suoritettiin työvaiheessa, jossa tutkittiin, pystytäänköENRI-aluetta monistamaan käyttäen RT-vaiheessa VP4/2 HRV/HEV OAS -alukkeita.TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
11Kuva 2. Pipetointikaavio: ENRI-alueen monistamisen testaus käyttäen eri alukkeita RT-vaiheessaEnsimmäiseen kahteen putkeen pipetoitiin pelkästään ENRI 4- aluketta. RT-vaiheen jälkeen tehtiin normaali qPCR-ajo käyttäen ENRI 4- ja ENRI 3 -alukkeita.Keskimmäisiin putkiin pipetoitiin VP4/2 HRV/HEV OAS aluketta RT-vaihetta varten, jonka jälkeen suoritettiin qPCR-ajo sekä ENRI-alueelle että VP4/2-alueelle.Oikeanpuoleisiin putkiin pipetoitiin kumpaakin aluketta ENRI 4- ja VP4/2HRV/HEV OAS aluketta, tehtiin RT-vaihe, jonka jälkeen suoritettiin qPCR ajokäyttäen sekä ENRI- että VP4/2-alueen alukkeita.TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
123 TULOKSET3.1 Annealing-lämpötilan optimointiTyössä testattiin qPCR-reaktiosarjojen kykyä monistaa rinovirusten VP4/2-geenialuetta ja samalla määritettiin optimaalinen annealing-lämpötila. VP4/2-geenialuetta pystyttiin tehokkaasti monistamaan Biorad C1000 Thermal Cycler-laitteella sekä KAPA- että SensiFAST-reaktiosarjalla. Kaikki lämpötilagradientinlämpötilat antoivat geelille näkyvän bändin. Gradientin neljä ensimmäistä lämpötilaa (52 - 55,9 C) antoivat kuitenkin parhaimman intensiteetin (Kuva 3). Tästäeteenpäin bändit alkoivat selkeästi haalenemaan lähestyttäessä 62 C:tta. Teoreettisten laskujen ja geelin intensiteettien perusteella päädyttiin jatkossa käyttämään 54 C:een annealing-lämpötilaa.Kuva 3. Annealing-lämpötila optimoinnin agaroosigeeliajot. A. pHRV-A-1b,KAPA; B. pHRV-A-1b, SensiFAST; C. pHRV-B14, KAPA; D. pHRV-B14, SensiFAST. Lämpötilagradientti: 1. 52,0 C, 2. 52,7 C, 3. 54,0 C, 4. 55,9 C, 5. 58,4 C, 6. 60,3 C, 7. 61,4 C ja 8. 62,0 C.3.2 qPCR-reaktiosarjojen vertailuTyössä vertailtiin KAPA-, SensiFAST- ja MAXIMA-qPCR-reaktiosarjojen kykyämonistaa rinoviruksen VP4/2-aluetta käyttäen pHRV-A-1b-plasmidia. Herkimmäksi qPCR-reaktiosarjaksi osoittautui KAPA SYBR FAST qPCR-reaktiosarjaCp-arvoina mitattuna. SensiFAST-qPCR reaktiosarjalla päästiin hyvin lähelleTURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
13KAPA:n arvoja kun taas MAXIMA qPCR-reaktiosarja jäi selvästi jälkeen muista.KAPA- ja SensiFAST-reaktiosarjalla pystyttiin kummallakin monistamaan näytteitä, joiden sisältämä genomin lukumäärä oli 102 kpl kun taas MAXIMA-reaktiosarjalla luku jäi 105:een (kuva 4).qPCR-reaktiosarjojen vertailu4540SensiFASTCp-arvot35KAPA30MAXIMA2520151 000 000100 00010 0001 000100Genomien lukumääräKuva 4. qPCR-reaktiosarjojen vertailu. Suoran pituus ja sijoittuminen kuvaajassakertoo reaktiosarjan herkkyydestä; mitä pidempi suora ja mitä alemmas suorasijoittuu, sitä herkempi qPCR-reaktiosarja on kyseessä.3.3 qPCR-menetelmän herkkyys ja VP4/2-alueen sulamislämpötilaqPCR-menetelmän herkkyys testattiin käyttäen kolmea HRV-plasmidia: pHRV A1b, pHRV-B14 ja pHRV-C15. Plasmideista tehtiin laimennossarja (106, 105, 104,103, 102,101,100 ja 10-1 genomia / µl), joilla suoritettiin qPCR-ajo. Kaikkia plasmideja pystyttiin monistamaan Roche Light Cycler 480 II -qPCR-laitteella käyttäenKAPA SYBR FAST qPCR-reaktiosarjaa. Geeliajojen perusteella menetelmälläpystyttiin monistamaan VP4/2-geenialuetta vielä 102 genomia / µl -laimennoksesta (kuva 5), kaikilla plasmideilla.TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
14Kuva 5. qPCR käyttäen HRV-plasmideja näytteinä. A) pHRV-A-1b, B) pHRV-B14ja C) pHRV-C15. Laimennokset: 1. 106, 2. 105, 3. 104, 4. 103, 5. 102Kuva 6. Cp-arvot näytteen genomien lukumäärän funktiona.102 laimennoksen intensiteetti jäi geelikuvissa hyvin pieneksi. Sulamiskäyrästäpystyttiin kuitenkin vahvistamaan tuotteen monistuminen. VP4/2 alueelle pystyttiin määrittämään tarkka sulamislämpötila ”Tm-calling”-analyysillä, jolloin sulamislämpötilaksi saatiin n. 83,5 C (kuva 4).TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
15Kuva 7. pHRV-C15-plasmidista monistetun VP4/2 alueen sulamiskäyrä.3.4 RT-entsyymien vertailuTyössä vertailtiin viittä erilaista RT-entsyymiä keskenään: SuperScript IV (SSIV,Invitrogen), SuperScript III (SSIII, Invitrogen), ImProm-II (Promega), RevertedAidReverse Transcriptase (M-MuL, Fermentas) ja AffinityScript (Agilent). Vertailutehtiin kummallekin RNA-näytteelle, HRV A-1b:lle ja HRV B14:sta. Kaikilla entsyymeillä transkriptio toimi hyvin; HRV A-1b RNA-näytteellä testattuna RT-entsyymeiden välillä ei ollut Cp-arvoissa mitattuna suuria eroja (kuva 8). HRV B14RNA-näytteellä testattuna RT-entsyymien välille tuli vain pieniä eroja Cp-arvoihin(kuva 9).TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
16RT-entsyymien Cp-arvot, HRV mProm IIM-MuLAffinityKuva 8. RT-entsyymien vertailu käyttäen HRV-A-1b:ta näytteenä.RT-entsyymien CP-arvot, HRV B141514Cp-arvo131211109SSIVSSIIIImProm IIM-MuLAffinityKuva 9. RT-entsyymien vertailu käyttäen HRV-B14:ta näytteenä.3.5 RT-entsyymin määrän vaikutus herkkyyteenImProm-II -RT-entsyymistä tehtiin laimennossarja, jossa entsyymiä laimennettiinaina puolella. Laimennokset olivat 1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 ja 1/32. Tulokset osoittivat, että 1/2-laimennosta voitiin vielä käyttää sen vaikuttamatta menetelmänTURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
17herkkyyteen. 1/4-laimennoksesta eteenpäin menetelmän herkkyys heikkeni huomattavasti (kuva 10). Sulamiskäyräanalyysit osoittivat, että 1/16- ja 1/32-laimennokset eivät tuottaneet lainkaan haluttua geenialuetta.RT-entsyymin laimennosten Cp osKuva 10. RT-entsyymin määrän vaikutus herkkyyteen3.6 ENRI-alueen monistaminen käyttäen VP4/2 HRV/HEV OAS-alukettaSulamiskäyräanalyysi ja näytteiden ajo agaroosigeelillä osoittivat, että cDNA:ta,joka oli tehty VP4/2 HRV/HEV OAS-alukkeella, ei pystytty qPCR-vaiheessa monistamaan tehokkaasti käyttäen ENRI-alukkeita. Sulamiskäyräanalyysin ja geeliajojen perusteella näytteeseen monistui myös jotain muuta tuotetta. ENRI-alueen monistus qPCR:llä, jonka RT-vaihe oli tehty VP4/2 HRV/HEV OAS-alukkeella, antoi sulamiskäyräanalyysissä kaksi selkeää piikkiä (kuva 12, vihreät käyrät). Geelillä vastaavat näytteet näkyivät ns. ylimääräisinä bändeinä (kuva 13, 4.ja 5.). Samat tulokset toistuivat, kun RT-vaihe tehtiin kummallakin alukkeella,ENRI 4- ja VP4/2 HRV/HEV OAS-alukkeilla samassa putkessa (kuva 13, 6. ja 7.)TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
18Kuva 11. Sulamiskäyräanalyysi: ENRI alueen monistaminen käyttäen VP4/2HRV/HEV OAS-aluketta. Vihreät käyrät: RT-vaihe VP4/2 HRV/HEV OAS alukkeilla tai VP4/2 HRV/HEV OAS ja ENRI 4- alukkeilla; qPCR ENRI-alueelle. Punaiset käyrät: RT-vaihe ENRI 4- -alukkeilla; qPCR ENRI-alueelle.Kuva 12. ENRI-alueen monistaminen käyttäen RT-vaiheessa VP4/2 HRV/HEVOAS -aluketta. 1. RT: HRV/HEV OAS, qPCR: VP4/2; 2. ja 3. RT:ENRI 4-, qPCR:ENRI; 4. ja 5. RT: HRV/HEV OAS, qPCR: ENRI; 6. ja 7. RT: HRV/HEV OAS jaENRI 4-; qPCR: ENRITURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
193.7 Rinovirustyyppien RNA:sta tehty RT-qPCRTyön lopussa testattiin optimoitua RT-qPCR-menetelmää 18:lle rinovirustyypille.Kaikki 18 rinovirustyyppiä antoivat positiivisen tuloksen, kun niitä testattiin optimoidulla menetelmällä. (kuva 14 ja 15). Sulamislämpötila kaikilla näytteillä oli n.83-84 C.Kuva 13. Rinovirustyyppien qPCR-monistuskäyrät.Kuva 14. Rinovirustyyppien qPCR-sulamiskäyräanalyysi.TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
204 TULOSTEN TARKASTELU4.1 Annealing-lämpötilan optimointiVP4/2 HRV/HEV OAS- ja OS -alukkeiden optimaalinen kiinnittymislämpötila olitulosten perusteella n. 52 - 55,9 C kummallakin testatulla qPCR-reaktiosarjalla.Näin ollen ks. alukkeille voidaan käyttää mitä vain annealing-lämpötilaa 52 - 55,9 C väliltä riippuen esimerkiksi ajetaanko samassa qPCR-ajossa jotain muita näytteitä eri alukkeilla, joiden kiinnittymislämpötila on lähellä VP4/2 HRV/HEV OAS jaOS alukkeita. Käytettäessä yli 58,4 C:een annealing-lämpötilaa, menetelmänherkkyys alkoi jo selkeästi huonontua. Tulokset osoittivat myös, että n. 650 emäksen pituista VP4/2-aluetta pystyttiin monistamaan käytetyillä qPCR-reaktiosarjoilla, vaikka valmistajat suosittelivat reaktiosarjoja korkeintaan 80–400 emäksenpituisille cDNA-jaksoille.4.2 qPCR-reaktiosarjojen vertailuqPCR-reaktiosarjan valinta voi olla iso kustannustekijä tutkimuksessa, joten ontärkeä tietää, mikä reaktiosarja toimii tehokkaimmin suhteessa sen hintaan. Kolmesta qPCR-reaktiosarjasta KAPA SYBR FAST osoittautui kaikista tehokkaimmaksi – tosin SensiFAST-qPCR-reaktiosarja ei jäänyt kauaksi KAPA:n tasosta(kuva 7). Kummallakin reaktiosarjalla saavutettiin sama herkkyys, eli pystyttiinmonistamaan vielä 100 genomia sisältävää näytettä. Ero SensiFAST:n jaKAPA:n välillä oli lähinnä Cp-arvoissa. MAXIMA qPCR-reaktiosarja oli selvästihuonoin - reaktiosarjalla pystyttiin monistamaan ainoastaan suuria määriä genomia sisältäviä näytteitä (106 ja 105 genomia/näyte). Tässä työssä reaktiosarjojavertailtiin ainoastaan pHRV-A-1b -näytteellä, joten jatkossa olisi vielä hyödyllistätestata, että pystytäänkö testin tulos toistamaan muilla näytteillä esim. HRV B14ja HRV C15-plasmideilla.Kaupallisia reaktiosarjoja on tarjolla useita erilaisia, joita kannattaisi vielä vertaillakeskenään käyttäen eri näytteitä.TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
214.3 qPCR-menetelmän herkkyys ja VP4/2-alueen sulamislämpötilaqPCR osoittautui melko herkäksi menetelmäksi monistettaessa VP4/2-aluettaHRV-plasmideilla. Menetelmällä pystyttiin vielä monistamaan luotettavasti kaikkia HRV-plasmidinäytteitä (pHRV-A-1b, pHRV-B14 ja pHRV-C15), jotka sisälsivät n. 100 genomia. Teoriassa tämä tarkoittaa, että kliinisestä näytteestä, jossaon ainoastaan 100 virusta/viruksen genomia, pystytään saamaan positiivinen tulos qPCR-menetelmällä. Täytyy kuitenkin huomioida, että plasmidinäytteet ovatusein hyvin puhtaita näytteitä, kun taas kliiniset näytteet voivat sisältää paljonmuuta DNA:ta. Nano Drop 1000 -laitteella mitattu konsentraatio ei myöskään olekovin tarkka mittaamaan DNA:ta, joten tulokset ovat vähintäänkin vain suuntaaantavia. Merkittävää oli kuitenkin todeta, että menetelmä toimi lähes samalla tavalla kaikille plasmidinäytteille.VP4/2-alueelle saatiin myös määritettyä sulamislämpötila, joka oli n. 83,5 C. Sulamislämpötilan määritys säästää aikaa lopputuloksen laadullisessa analysoinnissa, sillä näytteitä ei välttämättä tarvitse ajaa enää agaroosigeelille, jos sulamislämpötila vastaa näytteen odotettua lämpötilaa. Agaroosigeeliajo ei myöskään diagnostiikassa ole suositeltava tapa, koska tällöin lopputuote pitää ottaapois putkessa, mikä altistaa prosessin DNA-kontaminaatioille. Menetelmän validointivaiheessa on kuitenkin suositeltavaa ajaa näytteet myös geelillä, jos halutaan olla täysin varmoja positiivisita tuloksista. Tulosten perusteella laimein näytenäkyi geelillä vaikka sen muodostama monistuskäyrä oli matala ja Cp-arvo korkea. Tällaisen näytteen positiivisuuden tulkinta on vaikeaa pelkästään qPCR-laitteen mittausta käyttäen.4.4 RT-entsyymien vertailuTulokset osoittivat, että kaikki testattavat RT-entsyymit toimivat hyvin, eikä niidenvälillä ollut suuria eroja (kuva 9 ja 10). Erityisesti HRV-A-1b-näytteellä suoritettutesti antoi kaikilla RT-entsyymeillä lähes samat Cp-arvot. Suuremmat erot saattaisivat ilmetä jos RNA-näytteistä tehtäisiin laimennossarja. SuperScript IV-RT-TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
22entsyymillä suoritettu RT-vaihe on kuitenkin kaikista nopein. Muilla RT-entsyymeillä RT-vaihe kestää n. 45–75 min kun taas SuperScript IV-RT-entsyymiä käyttäen aikaa kuluu vain n. 20 min, mikä saattaa osoittautua kustannustehokkaaksitekijäksi tutkittaessa suuria määriä näytteitä.4.5 RT-entsyymin määrän vaikutus herkkyyteenRT-entsyymin määrä, jolla voidaan vielä saavuttaa hyvät ja luotettavat tulokset,on merkittävä kun halutaan optimoida mahdollisimman kustannustehokasta menetelmää. RT-entsyymi on yksittäisitä reagensseista suurin kustannustekijä, joten sitä ei haluta tuhlata suuria määriä. Tulokset osoittivat, että 0,25 µl:n määrä(1/2 normaalista määrästä) RT-entsyymiä käytettynä 10 µl:n reaktiotilavuudessaei vaikuttanut menetelmän herkkyyteen. Tällä voidaan tehdä jo merkittäviä säästöjä tutkimuksen kustannuksissa. RT-entsyymin määrän vaikutusta herkkyyteentestattiin käyttäen ainoastaan yhtä entsyymiä, ImProm II:sta, joten muidenkin entsyymien testaus voisi olla seuraava mahdollinen työvaihe.4.6 ENRI-alueen monistaminen käyttäen RT-vaiheessa VP4/2 HRV/HEV OASalukettaTulokset osoittivat, että RT-vaihe kannattaa aina tehdä halutun qPCR-tuotteenomilla alukkeilla. Käytettäessä VP4/2 HRV/HEV OAS -aluketta RT-vaiheessa taiENRI- ja VP4/2-alueen HRV/HEV OAS -alukkeita sekaisin, qPCR-vaiheessa syntyi myös sivutuotteita monistettaessa ENRI-aluetta. Sivutuotteet ilmenivät sulamiskäyräanalyysissä, jossa näkyi selkeästi kaksi erillistä piikkiä (kuva 12). Yleisesti tiedetään, että ENRI-alueen monistaminen RT-qPCR:llä on hyvin herkkämenetelmä. Seuraava työvaihe olisi ollut monistaa rinnakkain ENRI- ja VP4/2aluetta ja tutkia kummankin suhteellista herkkyyttä.TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
234.7 Rinovirustyyppien RT-qPCRTyön lopuksi testattiin optimoitua RT-qPCR menetelmää käyttäen erilaisista rinovirustyyppikannoista eristettyjä RNA-paloja näytteinä. Kaikki 18 rinovirustyyppiä antoivat positiivisen tuloksen, joten työssä optimoidun RT-qPCR-menetelmäntoimivuus pystyttiin vahvistamaan.TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
245 LOPPUPÄÄTELMÄTTyössä saavutettiin tärkein tavoite, joka oli monistaa rinovirusten VP4/2-aluettaRT-qPCR-menetelmällä. Samalla määritettiin menetelmän herkkyys. VP4/2-alueen pituuteen nähden menetelmä osoittautui melko herkäksi monistettaessaplasmidinäytteitä käytetyillä qPCR-reaktiosarjoilla. Työssä käytetty menetelmä oliloppujen lopuksi melko hyvin toimiva eri olosuhteissa; testien suorituksissa saatettiin käyttää mm. eri puskuriliuoksia ja RNA-inhibiittoreita ja silti saatiin luotettavia tuloksia.Työssä suoritettu RT-qPCR:n optimointi voisi olla esim. esityötä lopulliselle validoinnille. Seuraavaksi olisi loogista testata työvaiheiden toistettavuutta; samat tulokset tulisi saada riippumatta työn suorittajasta. Eri ihmisillä saattaa silti olla erilainen pipetointitarkkuus, mikä luo oman haasteen testien toistettavuudelle. Tärkeintä olisi ainakin itse saada samat tulokset jos olosuhteet ja reagenssit pysyvätsamoina.Toinen mahdollinen työvaihe olisi testata kliinisiä näytteitä, jotka on otettu suoraan potilaasta. Kliiniset näytteet saattavat sisältää suuria määriä muuta kuin halutun kohteen genomia, jotka saattavat vaikuttaa menetelmän herkkyyteen negatiivisesti. Tämän vuoksi olisi erityisen tärkeää testata pystytäänkö optimoitua RTqPCR-menetelmää käyttää diagnostisten näytteiden analysointiin.TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
256 LÄHTEET1C. Savolainen, S. Blomqvist, Mick N. Mulders. and T. Hovi, (2002) Jouurnal of GeneralVirology: Genetic clustering of all 102 human rhinovirus prototype strains: serotype 87 isclose to human enterovirus 702R. Österback,a T. Tevaluoto,a T. Ylinen,a V. Peltola,b P. Susi,a,c T. Hyypiä,a M. Warisa(2013), Journal of Clinical Microbiology: Simultaneous Detection and Differentiation ofHuman Rhino- and Enteroviruses in Clinical Specimens by Real-Time PCR with LockedNucleic Acid Probes3A. Wisdom, E. C. McWilliam Leitch, E. Gaunt, H. Harvala, and P. Simmonds (2009), Journal of Clinical Microbiology, Screening Respiratory Samples for Detection of Human Rhinoviruses (HRVs) and Enteroviruses: Comprehensive VP4-VP2 Typing Reveals High Incidence and Genetic Diversity of HRV Species C4S. Jacobs, D. Lamson, K. St. George and T. Walsh (2013) Human Rhinoviruses. Clin.Microbiol. Rev. January 2013 vol. 26 no. 1 135–16TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ Aleksi Saariranta
SYBR FAST (Kapa Biosystems) ja SensiFAST SYBR No-ROX (Bioline) -qPCR-reaktiosarjat oli-vat selkeästi herkempiä kuin edullinen MAXIMA SYBR Green (Fermentas) -reaktiosarja. Tulokset osoittivat, että VP4/2-aluetta pystyttiin monistamaan 100 rinovirusgenomia sisältävästä näyt-teestä. Menetelmä toimi tehokkaasti viljeltyjen rinovirus-RNA-näytteiden VP4/2-alueen monista- miseen .
